Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini akan membuatnya lebih cepat
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini sangat otomatis dan sangat peka. HPLC berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50µm sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi.
Di bawah ini merupakan diagram blok dari komponen peralatan HPLC
Gas terlarut suntikan atau kerangan
pencuplik sampel

Alat pengawasan Pemasukan sampel
pelarut

Ruang
termostatik

prakolom Kolom analisis


Reservoir pelarut

pembacaan
pengukur tekanan

penyaring


pompa



Pelepas tekanan dan kipas ke pembuangan detector ke pengumpulan penguat
Atau pembuangan

Pemisahan dengan pelarut tunggal disebut elusi isokratik, sedangkan elusi gradien dua pelarut dengan berbagai perubahan komposisi dialirkan. Suatu HPLC seharusnya mempunyai lebih dari dua penampang pelarut. Sebagian pompa HPLC mempunyai keluaran tekanan 1000-6000 psi, dan mampu menghasilkan aliran sampai 20 ml/menit. Pompa jenis punting sekrup screw driven pump dan pompa tarik dorong (reciprocating pump) sering digunakan. Screw driven pump menghasilkan pengaliran pelarut bebas pulsa. Sedangkan reciprocating pump lebih sering digunakan walaupun menghasilkan aliran berpulsa yang kelak harus ditiadakan. Reciprocating pump lebih populer karena dapat menggunakan volume yang tidak terbatas, eluen gradien juga hanya dapat dilakukan dengan reciprocating pump. Cairan tidak mudah dikompresi sehingga tekanan tinggi yang terbentuk pada sistem pompa tidaklah berbahaya. Prekolom berisi penunjang stasioner yang sama dengan kolom kromatografinya, hanya ukuran partikelnya saja yang lebih besar. Peranan prekolom terutama menghilangkan pengotor pada pelarut. Sampel dimasukkan dalam sistem injeksi dengan penyuntik hiperdemik. Sampel sampai sejumlah 2-1000l dapat ditampung dalam sistem injeksinya. Seperti pada kromatografi gas cair, suatu septum silikon atau teflon digunakan sehingga sistem injeksi dapat tertutup dengan sendirinya. Kolomnya dapat berupa gelas kaca atau baja tidak berkarat. Kolom gelas dapat menahan tekanan sampai 600 psi. Panjang kolom bervariasi dari 15-150 cm. Pengisi kolom biasanya adalah silika gel, alumina dan elit. Pengisi kolom seperti partikel pellicular yaitu butiran gelas yang dilapisi materi berpori seperti silika gel, alumina atau penukar ion juga sering digunakan.
Pemisahan dengan HPLC biasanya dilakukan pada temperatur kamar. Detektor yang digunakan pada HPLC bergantung pada tipe sampel yang dipisahkan. Dasar pengukuran UV, absorpsi IR, pendar fluor, indeks refraksi, konduktansi, polarografi, geiger counter, spektroskopi massa dapat digunakan. Kecuali indeks refraksi, detektor tersebut diatas bersifat sangat selektif. Detektor konduktometer dan polarografi dipengaruhi oleh variasi laju aliran. Detektor spektroskopi massa dan radioaktif tidak dipengaruhi temperatur, sedangkan detektor UV, IR dan pendar fluor sedikit dipengaruhi perubahan temperatur. Akurasi detektor fotometer lebih rendah daripada detektor spektofotometer. Detektor UV umumnya digunakan untuk analisis bahan organik bergugus fungsi. Detektor indeks refraksi akan memberikan respon terhadap semua jenis zat terlarut.
Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.
1. Fase Normal HPLC
Hal ini sama dengan tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai “normal”, ini bukan merupakan bentuk yang biasa dari HPLC. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom.
2. Fase Balik HPLC
Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom.
Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC
Jika melihat dari keseluruhan proses yang terjadi pada HPLC, maka dapat dilihat pada diagram alir berikut ini
Diagram alir HPLC


Injeksi sampel
Injeksi sample seluruhnya otomatis dan meliputi proses tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas.
Waktu retensi
Waktu yang dibutuhkan senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detector disebut waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
• tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
• kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
• komposisi yang tepat dari pelarut
• temperatur pada kolom
Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.
Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet. Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap


Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, sebaiknya digunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Selama dilakukan pengontrolan kondisi kolom, dapat digunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh. Dapat digunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuantitas dari senyawa yang dihasilkan. Dapat dianggap bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.
Jika akan menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.
Meskipun demikian, harus berhati-hati. Jika mempunyai dua substansi yang berbeda dalam sebuah campuran (X dan Y), maka tidak dapat dikatakan jumlah relatif jika menggunakan serapan UV sebagai metode pendeteksinya.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Kelebihan dari teknik HPLC dibandingkan dengan GC ( Gas Chromatography) :
1. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
2. HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi
3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi
4. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya
5. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)
6. Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat menurunkan biaya karyawan.
7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Beberapa kegunaan dari HPLC :
1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
5. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.